靶向代谢：肿瘤代谢物---2-羟基戊二酸（2-HG）及其手性物质的应用及拆分定量
α-酮戊二酸（α-KG，α- Ketoglutaric Acid）、2-羟基戊二酸（2HG，2-Hydroxyglutaric Acid）为人体代谢中重要的两类物质。其中2-羟基戊二酸有一对手性异构体（即光学异构体）L-2HG和D-2HG，分别具有不同的代谢路径和生物学意义，对疾病诊断治疗具有重要意义，建立α-酮戊二酸（α-KG）、L-2HG和D-2HG含量检测方法将有力推动临床研究。
α-酮戊二酸（α-KG）
α-酮戊二酸（α-KG），也被称为2-酮戊二酸、2-氧谷氨酸、2-氧戊二酸、氧戊二酸和2-氧戊二酸，其不仅是三羧酸循环（TCA）中重要的代谢中间产物，还是生物体内L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等多种氨基酸、维生素和有机酸的生物合成前体。机体内碳源物质转运进入细胞内后，可经过糖酵解形成丙酮酸，而丙酮酸进入三羧酸循环后可形成α-KG，生产的α-KG又可在α-酮戊二酸脱氢酶系的作用下进一步代谢成琥珀酰COA，进入碳代谢节点。这个过程伴随这电子传递和能量产生，可以为动物体的生长繁殖提供大量碳源物质和能量。此外，α-KG还可通过转氨基作用形成L-谷氨酸，进入氮代谢。所以α-KG是机体内连接碳代谢和氮代谢的重要中间产物。
α-KG作为连接碳氮代谢的节点，在细胞能量代谢中起着至关重要的作用，参与细胞供能、细胞内多种化学反应等，具有调节机体氮代谢、能量代谢、维持肠道健康、改善骨质、指导脂质合成、参与蛋白质修饰、调节细胞死亡、调节衰老等生理作用。
α-KG既能运输氮，也能储存氮，其作为谷氨酰胺的前体物质，能够在体内转化为谷氨酰胺。因此在促进动物生长养殖方面，目前由于集约化养殖和水体污染，水体常常氮含量过高，研究表明，α-KG的添加能够有效缓解鱼类氨氮胁迫，促进机体蛋白质的沉积，改善鱼体氮代谢。此外，在其他动物上，大量研究发现，日粮添加α-KG能够激活细胞内mTOR信号通路和提高饲料代谢能，促进机体蛋白质合成，从而提高动物的生长性能。在肠道内，谷氨酸和谷氨酰胺是肠粘膜细胞的主要能量来源，而α-KG作为这两种氨基酸的前体物质，能够在肠道内转化为谷氨酸和谷氨酰胺，为肠道提供能量。研究表明，日粮中添加α-KG还能降低机体MDA含量，升高SOD活性，提高机体抗氧化能力。在骨骼发育中，脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸是骨胶原生物合成的底物，而α-KG作为谷氨酸、谷氨酰胺的前体，能够为体内脯氨酸的合成提供底物，促进脯氨酸羟化形成羟脯氨酸，间接促进机体骨胶原的合成。在衰老方面，α-KG代谢抑制TOR功能，提示α-KG可能在抑制肿瘤中发挥重要作用。
2-羟基戊二酸（2HG）和L-2HG、D-2HG
2-羟基戊二酸（2HG，2-Hydroxyglutaric Acid）是一种内源性代谢物，是一种在第二碳或α碳上有一个羟基的5-碳二羧酸，根据连有羟基的第二位碳原子的手性不同，2HG可分为一对手性异构体（即光学异构体）：D-2HG和L-2HG[1]。这些立体异构体具有相同的物理性质，然而它们具有不同的三维空间构型，因此可以被不同的酶识别。
正常情况下，哺乳动物中细胞中的L-2HG被认为是由苹果酸脱氢酶（MDH）或在缺氧条件下被乳酸脱氢酶A（LDH-A）氧化α-KG而形成，并被L-2-羟基戊二酸脱氢酶(L2HGDH)转化为α-KG[2-6]。D-2HG是由羟基酸-含氧酸转氢酶（HOT）将α-KG氧化而成，可由D-2-羟基戊二酸脱氢酶(D2HGDH)转化为α-KG[7]，从而使其保持一个动态平衡的状态。正常的生物体会产生极其微量的2HG来参与代谢（约<100 mM），但是当生物体内的异柠檬酸脱氢酶（IDH）发生变异时，会导致D-2HG在人体内异常累积。IDH1和IDH2分别表达于细胞质和线粒体中，主要功能为催化异柠檬酸脱羧生成α-KG，突变后的IDH1和IDH2获得新的催化活性，会催化α-KG生成D-2HG，从而导致D-2HG在人体内大量累积[8]。而L-2-羟基戊二酸脱氢酶（L2HGDH）的低表达，则会使 L-2HG的含量异常升高[9]。
图1 α-KG, D-2HGL-2HG在生物体内的代谢[10]
生理作用
2-羟基戊二酸（2HG），d-2HG和L-2HG是“肿瘤代谢物”，它们是驱动不同癌症的致病因子。D-2HG和L-2HG的异常升高，会导致不同类型的神经代谢障碍性疾病或肿瘤的发生。尽管2-HG的生理功能尚不明确，但由于2-HG在人类体内的异常积累与一种罕见的神经代谢疾病2-羟基戊二酸尿(2-HGA，2-hydroxyglutaric aciduria)和多种癌症的发病机制有关，因此2-HG已经引起了广泛的关注。
2-HGA是一种罕见的常染色体隐性遗传神经代紊乱性疾病，以患者的血、尿及脑脊液中2-HG浓度升高为主要特点，患者在临床上表现为不同程度的发育迟缓、智力减退、癫痫、脑部异常等症状，该病目前尚无有效的治疗手段。由L2HGDH突变引起的L2HGDH功能缺失会导致L-2-HGA，由D2HGDH突变引起的D2HGDH缺陷，会导致D-2-HGA[11]。
在癌症中，D-2-HG是由α-KG通过IDH 1/2突变产生的。IDH 1/2野生型肿瘤在缺氧条件下，通过MDH和LDH酶从α-KG合成L-2-HG，但浓度较低。两种2-HG的亚型结构与α-KG相似，会抑制ATP合成酶和α-KG依赖性双加氧酶（如组蛋白和DNA去甲基酶）。但它们的功能不同，D-2-HG增强了Egln1（一种破坏HIF-1α的脯氨酸羟化酶）的活性，然而L-2-HG会抑制它。L-2-HG的产生被认为是帮助细胞适应缺氧氧化还原变化的反应。因此，2-HG的两种亚型都与癌症有关，并可能影响肿瘤的表观遗传状态。
2022年9月，来自哈佛大学的Marcia C. Haigis团队在Science发表的题为“Oncometabolite D-2HG alters T cell metabolism to impair CD8+ T cell function”的论文[12] ，发现D-2HG改变CD8+ T细胞的代谢，抑制其免疫功能。人类癌症中异柠檬酸脱氢酶（IDH）的功能突变导致D-2-羟基戊二酸（D-2HG）的产生，文章比较了D-2HG和其对映体l-2HG，发现肿瘤衍生物D-2HG被CD8+T细胞吸收，并以急性和可逆的方式改变CD8＋细胞的代谢和抗肿瘤功能。发现糖酵解酶乳酸脱氢酶（LDH）是D-2HG的分子靶点。D-2HG和对LDH的抑制推动了代谢程序和免疫CD8+T细胞的特征，其特点是细胞毒性下降和干扰素-γ信号的受损，这在人类IDH1突变胶质瘤患者的临床样本中得到重现。这一发现也为研发针对IDH和D-2HG的肿瘤免疫疗法提供了新思路。
产品情况介绍
由此看来，作为2-HG的两种对映体，D-2HG与L-2HG具有不同的代谢路径和生物学意义，并可在一定条件下与α-KG可以相互转化，被认为是两种独立的代谢物。因此在临床与科学研究中，分别测定D-2HG、L-2HG和α-KG是准确诊断 2-HG相关疾病的前提，对诊断相关疾病具有重大意义，对肿瘤的筛选和用药指导非常重要。且目前对于D-2HG或L-2HG的积累如何在某些组织中发挥致瘤作用还尚不完全清楚。
但通常情况系，这三种物质直接提取经过LC-MS/MS仪器后会得出完全相同的液质图谱，无法分离，更无从测量单独含量，这也是以往报道的检测方法大多只能检测总2HG含量的原因。
目前，联川生物已开展针对α-KG、L-2HG、D-2HG的服务，能够有效且稳定分离这三种物质，满足对各靶标代谢物进行准确定量的要求，助力临床及科学研究。标准曲线和仪器谱图如下所示：
表1 标准曲线信息
图2 仪器谱图
样本要求
样本要求:
组织：>200mg
血液：>200uL
细胞：>5×107
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参考文献
[1] Paolo Fortina et al. (eds.), Acute Myeloid Leukemia: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology.
[2] Struys EA, Verhoeven NM, Jansen EE, et al. Metabolism of γ -hydroxybutyrate to d -2-hydroxyglutarate in mammals: further evidence for d -2-hydroxyglutarate transhydrogenase[J]. Metabolism, 2006, 55( 3):353-358.
[3] Struys EA, Verhoeven NM, Ten Brink HJ et al.Kinetic characterization of human hydroxyacid-oxoacid transhydrogenase: relevance to D-2-hydroxyglutaric and gamma-hydroxybutyric acidurias. J Inherit Metab Dis. 2005;28(6):921-30.
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[7] Struys EA. D-2-Hydroxyglutaric aciduria: unravelling the biochemical pathway and the genetic defect. J Inherit Metab Dis. 2006 Feb;29(1):21-9.
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[11] Yang J, Zhu H, Zhang T, Ding J. Structure, substrate specificity, and catalytic mechanism of human D-2-HGDH and insights into pathogenicity of disease-associated mutations. Cell Discov. 2021 Jan 12;7(1):3.
[12] Notarangelo G, Spinelli JB, et al. Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8+ T cell function. Science. 2022;377(6614):1519-29
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